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我最近在用FITC 看細胞膜的蛋白
不過我今天染完2抗 過了半小時後拿到顯微鏡下觀察
我發覺細胞都是綠綠的
不知道到底有沒有染到
要怎麼樣才能確定自己是染到的呢
還是non-specific binding
我的做法是
固定用稀釋10倍的弗馬林 5分鐘
接著用methanol:acetate v/v=1:1 固定1分鐘
再用3%H2O2 10分鐘
加1抗 1:100 overnight
隔天加2抗 1:100 30min r.m
全程用PBS wash
想請問大家的是用PBS wash你們都會等一陣子在洗掉嗎 例如1分鐘後
還是加下去馬上洗掉呀
另外就是blocking一定要作嗎
因為我們家好像都沒做 不知道會不會是因為這個影響
請各位幫我解答疑問 謝謝
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 61.230.67.218
> -------------------------------------------------------------------------- <
作者: aggaci (五子棋啦) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 免疫螢光染色
時間: Sat May 21 23:50:30 2005
※ 引述《ushn (曬的好黑喔~~~這樣啦 晚)》之銘言：
: 我最近在用FITC 看細胞膜的蛋白
: 不過我今天染完2抗 過了半小時後拿到顯微鏡下觀察
: 我發覺細胞都是綠綠的
: 不知道到底有沒有染到
: 要怎麼樣才能確定自己是染到的呢
: 還是non-specific binding
: 我的做法是
: 固定用稀釋10倍的弗馬林 5分鐘
: 接著用methanol:acetate v/v=1:1 固定1分鐘
: 再用3%H2O2 10分鐘
: 加1抗 1:100 overnight
: 隔天加2抗 1:100 30min r.m
: 全程用PBS wash
最好加Triton X-100 以及 BSA或1%血清
: 想請問大家的是用PBS wash你們都會等一陣子在洗掉嗎 例如1分鐘後
: 還是加下去馬上洗掉呀
: 另外就是blocking一定要作嗎
一定要!完全比照western blot!
: 因為我們家好像都沒做 不知道會不會是因為這個影響
: 請各位幫我解答疑問 謝謝
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.114.100.165
> -------------------------------------------------------------------------- <
發信人: [email protected] (六百), 看板: Biotech
標 題: Re: [問題] 免疫螢光染色
發信站: 清華生命科學 BBS (Sun May 22 02:00:34 2005)
轉信站: ptt!Group.NCTU!grouppost!Group.NCTU!nthuls
※ 引述《[email protected] (五子棋啦)》之銘言：
> : 另外就是blocking一定要作嗎
> 一定要!完全比照western blot!
其實我很懷疑
如果是染culture的cell, culture的時候就有加血清
此時blocking是否還是必要
因為10%的血清大概已經跟大部分用血清block的protocol建議的濃度一樣了
(還看過有1%血清的protocal)
至於說抗體的working buffer裡面同時block
即使western也不是所有protocol都要這樣做的
--
莫非定律:
到了期末才會想起期初曾選了一門課卻一直沒去上
補充定律:
拿到成績單才發現上了一學期的課忘了去考期末考
--
※ Origin: 生命科學 BBS <bbs.life.nthu.edu.tw>
◆ From: 210-85-213-142.cm.dynamic.apol.com.tw
> -------------------------------------------------------------------------- <
作者: pacity () 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 免疫螢光染色
時間: Tue May 24 20:24:30 2005
※ 引述《ushn (曬的好黑喔~~~這樣啦 晚)》之銘言：
: 我最近在用FITC 看細胞膜的蛋白
: 不過我今天染完2抗 過了半小時後拿到顯微鏡下觀察
: 我發覺細胞都是綠綠的
: 不知道到底有沒有染到
: 要怎麼樣才能確定自己是染到的呢
: 還是non-specific binding
: 我的做法是
: 固定用稀釋10倍的弗馬林 5分鐘
: 接著用methanol:acetate v/v=1:1 固定1分鐘
: 再用3%H2O2 10分鐘
: 加1抗 1:100 overnight
: 隔天加2抗 1:100 30min r.m
: 全程用PBS wash
: 想請問大家的是用PBS wash你們都會等一陣子在洗掉嗎 例如1分鐘後
我們家會shake 2分鐘左右再洗掉..
: 還是加下去馬上洗掉呀
: 另外就是blocking一定要作嗎
: 因為我們家好像都沒做 不知道會不會是因為這個影響
: 請各位幫我解答疑問 謝謝
有可能
你有沒有negative control啊???
就是不加一抗或是加一抗以及他自己的antigen
如果有的話 就把你的實驗組跟control比較看看...
基本上 如果沒有control
實驗做出來的data會比較沒意義喔..
--
話說我現在的immunostain正在blocking中XD
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--
好的開始是成功的一半...
壞的開始是成功的另一半
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.129.74.200
> -------------------------------------------------------------------------- <
作者: kib30370 (3c) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 免疫螢光染色
時間: Tue May 31 13:45:06 2005
※ 引述《pacity ()》之銘言：
: ※ 引述《ushn (曬的好黑喔~~~這樣啦 晚)》之銘言：
: : 我最近在用FITC 看細胞膜的蛋白
: : 不過我今天染完2抗 過了半小時後拿到顯微鏡下觀察
: : 我發覺細胞都是綠綠的
: : 不知道到底有沒有染到
: : 要怎麼樣才能確定自己是染到的呢
: : 還是non-specific binding
: : 我的做法是
: : 固定用稀釋10倍的弗馬林 5分鐘
: : 接著用methanol:acetate v/v=1:1 固定1分鐘
: : 再用3%H2O2 10分鐘
: : 加1抗 1:100 overnight
: : 隔天加2抗 1:100 30min r.m
: : 全程用PBS wash
: : 想請問大家的是用PBS wash你們都會等一陣子在洗掉嗎 例如1分鐘後
: 我們家會shake 2分鐘左右再洗掉..
: : 還是加下去馬上洗掉呀
: : 另外就是blocking一定要作嗎
: : 因為我們家好像都沒做 不知道會不會是因為這個影響
: : 請各位幫我解答疑問 謝謝
: 有可能
: 你有沒有negative control啊???
: 就是不加一抗或是加一抗以及他自己的antigen
: 如果有的話 就把你的實驗組跟control比較看看...
: 基本上 如果沒有control
: 實驗做出來的data會比較沒意義喔..
我們家的作法是先用PBS將medium洗乾淨
再浸泡在4%的formaldehyde(PBS稀釋)中15分鐘
PBS wash後再泡cold acetone 30秒
加1抗 4oC O/N or rm 1 hr
PBS wash 3 times
加2抗 rm 30 min
加DAPI rm 5 min
PBS wash 3 times
封片
我們都沒有blocking
參考看看!!
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.109.40.70
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