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primer 回溶 加熱 在 Re: [問題] 關於溶解DNA - 看板Biotech - 批踢踢實業坊 的推薦與評價
※ 引述《linzhengzhan (研究所:碩士班vs博士班)》之銘言:
: ※ 引述《ppqu4 (屁啦)》之銘言:
: : 請問DNA在用酒精濃縮後
: : 有些protocal說可用TE buffer 溶解
: TE buffer 利於長期何保存DNA (因為tris為good buffer,EDTA為metal的螯合劑)
: 可避免pH值的劇烈變化,亦可保護DNA不受DNase破壞。
: : 也有的說可以用二次水 (有的說室溫也有的說4度C)
: ddH2O可用於短期的回溶;如果想溶的又好又快,可以用ddH2O,但不利於長期保存。
: 回溶的溫度 (我的經驗)
: →in Room Temperture,30min~overnight →store in 4℃
: →in 37℃,1~1.5hr →操作實驗
: →in 4℃,沒試過;我用4℃是用於保存DNA的
: : 不曉得這三者有何差別?
: : 而且有的還會建議說
: : 用TE buffer溶的可以37度C加熱數分鐘幫助溶解
: : 用二次水溶的可用56度C幫助溶解
: 只要DNA不denatur的話,高於常溫,應該是可以接受的 (重點是不要破壞DNA)
: 溫度的高低,只是回溶的效果與時間上的關係,只要時間夠,自然就能夠回溶完全。
: : 請問為何會有溫度上的差別呢??
: : 想知道原因是什麼?
: : 懇請解惑 XD
: : 謝謝
謝謝你的回答~
我查到書上的說明的確也是像你說的用TEbuffer加熱37℃助溶
不過問過實驗室的人幾乎全都是用ddH2O回溶然後直接冰4℃ 甚至-20℃
卻沒聽他們說有發生不良的情況
所以才覺得很好奇...
而且學長說加熱56℃幫助回溶的原因
與最一開始加buffer到組織中加熱56℃的理由一樣
不過我不懂的地方是
如果是要使proteinase K反應的話 37℃就夠了
為何需要加熱到56℃(許多實驗室甚至加熱到65℃)
是為了破菌或是抑制DNase的反應嗎?
我聽說有些人在使用primer之前也會先加熱到56℃
不曉得是否也是同樣的道理?
另外 不曉得大家是否有發生過酒精倒掉後倒扣overnight卻還不乾的情況
我查過書也問過其他實驗室的做法
有的是直接用speedvac 有的直接拿去加熱蒸乾
還有的是再離心一次直接用pipet把剩下的水吸出來
而書上是建議用毛細吸管不然就是用真空乾燥器或冷凍乾燥器
不過書上有特別說明即使離心過DNA還是不會緊附在離心管壁上
所以直接用pipet吸剩下水的方式是不是很不保險阿 (尤其狀況很差的情況下) XD
但如果沒有speedvac也沒有毛細吸管的話該怎麼辦...
雖然有人是說擺了兩三天還是不乾就直接加水回溶保存算了
恩..以上是一些蠻細節的小問題啦
每種方法都有人做..而做的人也都說好像沒差
但我還是想了解這之中是否會有些原理上的差別
我查過的書是molecular cloning -a laboratory manual
還有 gene cloning and DNA analysis- an introduction
都沒看到關於這些細部的解釋
至於聖經molecular clone也是找不到
是否可以指點一下哪裡可以查到這些方法步驟的原理說明呢?
謝謝囉~
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